Le origini del Santuario risalgono al 15 maggio 1345, festa di Pentecoste, quando, secondo la tradizione, un povero pastore storpio trovò l'immagine miracolosa della Vergine Maria e seguendo un'intuizione interiore la portò sul colle di Montenero, luogo già conosciuto come rifugio di briganti e per questo considerato oscuro, tenebroso... il "monte del diavolo". Al di là delle molte leggende che circondano la storia del ritrovamento dell'immagine della Madonna, che la critica attribuisce invece ad un certo Iacopo di Michele detto Gera, sembra che tale immagine sia comparsa a Montenero in seguito a una rinascita di fervore religioso, intorno al 1341. Proprio in questo anno gli abitanti di Livorno, allora poco più di un villaggio di pescatori, avrebbero organizzato un culto autonomo di immagini sacre, dipinte di recente, osteggiato però dalle autorità ecclesiastiche che intimarono la cessazione del culto e la sparizione delle relative immagini. Non è da escludere che davanti a questa ostilità, l'immagine sia stata occultata e poi ritrovata vicino al greto del fiume ''Ardenzo'', da quel pastore che solerte la portò in cima al monte per affidarla quasi sicuramente alla custodia di qualche eremita. La fama dell'immagine miracolosa si diffuse presto, a motivo delle tante grazie operate dalla Beata Vergine; cominciano i pellegrinaggi e con essi crescono le offerte per il piccolo oratorio che ospita la Madonna. Già nel 1380 furono iniziati i lavori per ampliare la Cappella e i locali che servivano al riparo dei pellegrini. Ai primi custodi del santuario, quasi sicuramente i frati terziari, seguirono le custodie dei Gesuati (dal 1442 al 1668) e dei Teatini (dal 1668 al 1792 ) indicati allora come i più qualificati ad espletare il servizio presso il Santuario. Infatti nel 1720, i Teatini iniziarono i lavori di ampliamento del Santuario che terminarono nel 1774. In questo lasso di tempo la Madonna di Montenero operò alcuni miracoli a favore di tutta la città tra i quali quello del 1742 quandò la città fu sconvolta da un violento terremoto e ancora una volta soccorsa dalla sua protettrice e dalla sua immagine che fu trasportata in città e posta davanti alla Collegiata. A Livorno quel miracolo non fu mai dimenticato tanto che ogni anno si rinnova il voto che i livornesi fecero alla Madonna "...di digiunare in perpetuo il 27 gennaio, di non fa balli, né maschere, di assistere nella Collegiata stessa all'annua funzione di ringraziamento...''. Nel 1792 il Santuario fu affidato ai Monaci benedettini Vallombrosani che ne sono attualmente i custodi.